随着生物科技的发展，生物治疗业已成为重要的前沿疾病治疗技术，其中利用RNA体外合成技术制备的mRNA疫苗在2020年大爆发的COVID-19传染病上产生了巨大的影响。很多公司如美国Moderna、德国CureVac、BioNTech等均已经开展了其他疾病如肿瘤、传染病、慢性病等治疗性mRNA疫苗和药物开发。

mRNA疫苗

mRNA（Messenger RNA或信使RNA）在人类生物学中起着基本作用，它转移存储在DNA中的指令来制活细胞所需的蛋白质。mRNA疫苗是将RNA在体外进行相关的修饰后传递至机体细胞内表达并产生蛋白抗原，从而导机体产生针对该抗原的免疫应答，进而扩大机体的免疫能力^[^2,3^]。mRNA疫苗分为非复制性mRNA(nonreplicating mRNA)和自扩增mRNA(self-amplifying mRNA)两类：自扩增mRNA不仅编码目标抗原，而且还编码能够使细胞内RNA扩增和蛋白表达的复制机制。非复制性mRNA疫苗仅编码目标抗原并包含5′和3′非翻译区（UTR），它们提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递。

mRNA疫苗开发流程包括病原体识别、测序、mRNA体外合成和修饰、纯化等操作。

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图1. mRNA疫苗的示意图及其抗原表达的机制^[4]

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图2. mRNA疫苗生产制备流程图^[^5]

在mRNA疫苗和基因治疗等领域中，高效合成高质量的mRNA是实现疗法目标的关键步骤。而在这一过程中，T7 RNA聚合酶扮演着至关重要的角色，它能够高效地催化体外合成mRNA的过程。

尽管T7 RNA聚合酶在mRNA合成中发挥着重要作用，但实际操作中经常会产生双链RNA（dsRNA）这一副产物。dsRNA的存在不仅降低了mRNA的产量和纯度，还可能激发非特异性免疫反应，影响疗效和安全性。因此，减少dsRNA的产生成为了行业的一个迫切需求。

永利3044集团官网利用其ZymeEditor定向进化平台的能力，持续在进化mRNA体外合成的核心酶原料—T7 RNA聚合酶，开发出一款低dsRNA T7 RNA 聚合酶，可大幅度降低dsRNA，

» 产品特点

产量：均稳定在9mg/mL
dsRNA含量：野生型T7 RNAP的dsRNA的含量显著降低了10倍以上
片段加帽率高：均超过99%

»产品数据

在不同长度的应用场景下，dsRNA无论跟WT T7 ，还是竞品，在保证其他指标不降的前提下，dsRNA 均有大幅度下降。

片段长度	T7 RNA pol	产量（mg/mL）	完整度（%）	dsRNA含量（(1ug RNA产生 ng的dsRNA)
4K	T7-WT	12.4	88.3	0.4273
	T7-低dsRNA	12.1	89.9	0.0129
	竞品	11.0	87.8	0.0323
9K	T7-WT	9.5	81.9	2.9180
	T7-低dsRNA	9.0	82.0	0.0379
	竞品	7.2	78.7	0.1805

2、降低Cap analog的投入量，在不同的片段长度，以及与WT的对比下，投入量降低到2.5mM，仍能得到优异的加帽率。同时在细胞层面上，也能得到优异的表现。

Cap analog投入量（mM）	加帽率（%）-4K		1K
Cap analog投入量（mM）	WT	mutant	WT
10	100	100	100
5	100	100	100
2.5	100	100	99.7

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产品名称	货号	规格
CleaScrip™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA, 250 U/μL)	10628ES10/60/72	10KU/100KU/250KU

mRNA体外合成

体外合成RNA（IVT）主要是以DNA为模板通过体外转录得到，常用的是以线性化质粒DNA或PCR扩增产物为模板利用RNA聚合酶在体外转录合成。主要过程是利用含有T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）或SP6启动子（ATTTAGGTGACACTATAG）序列的DNA为模板在含有T7或SP6 RNA聚合酶的条件下，以NTP为底物合成与模板DNA中一条链互补的mRNA，简单快速获得大量的mRNA分子，通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。

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图3. 体外转录（IVT）mRNA生产和装配过程^[6]

永利3044集团官网经过匠心研发开发出的Hifair^®T7 High Yield RNA Synthesis Kit高产量体外合成试剂盒包含一整套的RNA合成所需试剂，并配有详细的教程。试剂盒可以合成长转录本以及短转录本，以1μg的模板投入量可以产生100-200 μg的RNA，适用于单链 RNA合成（包括siRNA等各类RNA前体及RNA探针）和以Cap analog为引物合成Capped mRNA。

» 产品特点

高产量：2h内产生100-200µg，单次放大反应可产生毫克级RNA

多功能: 适用于长片段和短片段RNA转录

灵活性: 可获得无标记、标记以及加帽的RNA

» 测试数据

图4. 不同长度转录-时间梯度电泳图

图5. 不同目的片段的转录产量

图6. 不同目的片段的转录产物品质

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产品名称	货号	规格
Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit	10623ES50/60	50/100T

mRNA修饰

由于RNA的稳定性较弱，因此合成后的mRNA稳定性是必须要重点关注的问题。通常需要通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。永利3044集团官网提供低残留和高效加帽的Vaccinia Capping Enzyme（牛痘病毒加帽酶）是经过GMP生产获得，完全满足疫苗生产所需，并提供其他相关的酶类和试剂。

» 产品特点

生产工艺：GMP工艺生产

残留：无核酸酶、内毒素含量低

来源：大肠杆菌重组表达

纯度高：纯度 >95%（SDS-PAGE）

比活：~160000U/mg(BCA)

» GMP级别质检

质检项目	蛋白酶	核酸外切酶	切口酶	RNA酶	内毒素	宿主蛋白	宿主核酸	无菌检测	病原体	支原体	…
质检项目	√	√	√	√	√	√	√	√	√	√

注：具体质检标准及数据参考具体COA，病原体包括HBC/HCV/HIV，其他产品病原体检测均是。

» 加帽效率

质谱测定两种酶的加帽效率，并与对照品的酶加帽效率进行对比，可以发现永利3044集团官网的加帽效率比较高，获得的产物的纯度也较高。

» 残留检测

分别检测Rnase、核酸酶、切口酶、大肠杆菌DNA残留，经检测结果显示，成品无相关酶的残留，且表达的宿主DNA残留也达到了要求标准。

» 相关产品

产品名称	货号	规格
UCF.ME® mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade	10614ES84/92/94	2000/10000/20000U

mRNA残留去除

合成后的产物可能会有DNA残留，在疫苗开发阶段，残留的去除是关键的步骤，以减少下游纯化难度并增加产品的纯度。永利3044集团官网开发的DNase I是通过原核生物表达并经过GMP工艺生产，满足疫苗开发的需求。

» 产品特点

生产工艺：GMP工艺生产

残留：无核酸酶、内毒素含量低

来源：大肠杆菌重组表达

纯度高：≥80% by Biuret

酶活：≥2000 Kunitz Units/mg protein

» GMP级别质检

质检项目	蛋白酶	核酸外切酶	切口酶	RNA酶	内毒素	宿主蛋白	宿主核酸	无菌检测	病原体	支原体	…
质检项目	√	√	√	√	√	√	√	√	√	√

注：具体质检标准及数据参考具体COA

» 测试数据

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图7. RNAse残留检测

通过SDS-PAGE分析确定的DNase I（无RNase）纯度约为95%。

图8. DNase I（无RNase）纯度检测（SDS-PAGE）

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产品名称	货号	规格
UCF.ME^®Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade	10611ES76/84	500/2000U

mRNA纯化

在经历严格的合成及修饰后，所获得的mRNA需要进一步的纯化以达到后续研究的纯度标准。永利3044集团官网开发的mRNA纯化磁珠是偶联了Oligo（dT）的微米级顺磁性微球。运用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，特异地将mRNA从总RNA中分离出来。

» 产品特点

高效率：mRNA纯化在45min内完成

高纯度：Oligo(dT) 磁珠特异性吸附mRNA

灵活：兼容手动和自动化操作平台

可靠：获得的mRNA适用NGS、体外翻译、RT-PCR和CDNA合成

» 纯化效果好

使用磁珠纯化拟南芥和小鼠肝组织RNA样本，Hieff NGS^® mRNA Isoaltion Beads的mRNA回收效率更高，rRNA的去除效果更好。

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图9. mRNA Isolation Kit纯化不同RNA样本中的mRNA 管家基因产量表征mRNA回收效果。rRNA相关基因产量表征rRNA去除效果

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图10. mRNA 纯化操作流程

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产品名称	货号	规格
Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit mRNA 纯化试剂盒	12603ES24 /96	24/96T

永利3044集团官网作为分子酶领域创新领导者，专注为您提供高品质的分子酶产品及相关试剂盒，为您的科学研究和药物及疫苗的开发提供更多选择和方便，也为人类的未来健康事业奉献一份力量。

其他相关产品

产品名称	货号	规格
T7 RNA Polymerase GMP-grade (250 U/μL)	10625ES10/60/86	10/100/2500KU
CleaScrip™ T7 RNA Polymerase (low dsRNA, 250 U/μL)	10628ES10/60/72	10/100/250KU
UCF.ME® Murine RNase inhibitor GMP-grade (40 U/μL)	10621ES10/20/60	10/20/100KU
UCF.ME® Pyrophosphatase, Inorganic GMP-grade (1 U/μL)	10620ES10/60/80	10/100U/1000U
Hifair ® T7 High Yield RNA Synthesis Kit	10623ES50/60/70	50/100/500T
UCF.ME® mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade(10 U/μL)	10614ES84/92/96	2/10/100KU
UCF.ME® mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-grade(50 U/μl)	10612ES92/97/98	10000/50000/250000U
S-adenosylmethionine (SAM)	10619ES02/25/50	0.5/25/50mL
UCF.ME® DNase I,RNase-free，GMP-grade	10611ES76/84/92	500/2000/10000U
GTP Tris Solution GMP-grade (100 mM)	10655ES03/10/60	1/10/100mL

【1】Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.

【2】苗鹤凡, 郭勇, 江新香. mRNA疫苗研究进展及挑战[J]. 免疫学杂志, 2016(05):446-449.

【3】Kramps T., Elbers K. (2017) Introduction to RNA Vaccines. In: Kramps T., Elbers K. (eds) RNA Vaccines. Methods in Molecular Biology, vol 1499. Humana Press, New York, NY.

【4】Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.

【5】Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,

【6】Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,

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